2020年6月，青島農業大學園藝學院果樹生理與栽培課題組在園藝領域頂級期刊Horticulture Research（一區）在線發表了題為“Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica”的研究論文。該論文首次發現Fluo-8/AM等小分子熒光探針可以染色蘋果果肉胞質中的Ca2+，可用于檢測細胞質中Ca2+的時空變化。青島農業大學園藝學院碩士研究生仇麗娜為本論文第一作者，青島農業大學園藝學院王永章教授和屈海泳副教授為論文的共同通訊作者。該論文得到了國家重點研發計劃項目（2016YFD0201120）的資助。

　　鈣既是植物所必需的礦質元素，又是細胞信号物質，在細胞内的分布呈現出複雜的時空動态變化。園藝植物的許多生理病害由Ca2+分布不平衡和代謝失調引起的，如蘋果苦痘病、梨褐斑病、番茄臍腐病等，果實品質受損，經濟效益下降。在蘋果生産過程中，對幼果噴鈣、采後浸鈣等處理能增強蘋果果實硬度，延緩果實衰老軟化，延長存儲時間，提高果實外觀品質，然而也有研究結果表明鈣處理對果實品質沒有影響，也不能降低蘋果苦痘病的發病率。這些研究結果之所以相互矛盾，主要原因是鈣能否被果肉細胞吸收及其在細胞中的作用尚不清楚。Ca2+熒光呈像是最直觀有效的研究細胞Ca2+的方法。對于不易建立穩定轉基因植物，如蘋果、梨等果樹，采用小分子Ca2+熒光探針裝載進入細胞，非常有利于研究細胞中Ca2+的分布和變化，但是小分子熒光探針容易發生‘區室化’現象，降低了他的可靠性。

　　Fig.1 Protoplasts were obtained by enzymatic hydrolysis.

　　本研究首次從成熟‘富士’(Malus domestica Borkh. cv. Fuji)蘋果果肉組織細胞中通過酶解獲取原生質體，在37°C（30 min）下将小分子熒光試劑裝載到原生質體中，通過觀察熒光顯微鏡檢測果肉組織細胞質中的Ca2+。以目前最常用的Fluo-8/AM、Fluo-4/AM和Rhod-2/AM這3種熒光試劑進行果肉原生質體染色，采用Ca2+通道阻斷劑La3+、Ca2+螯合劑EGTA、Ca2+載體A23187和Ionomycin，調節細胞内的Ca2+濃度，檢測熒光值的變化。主要結果：（1）經FDA檢測，酶解分離出的蘋果果肉原生質體具有活性；（2）Fluo-8/AM等化學熒光試劑可以成功染色蘋果果肉胞質中的Ca2+，當終濃度為5 μmol/L時熒光強度最強，且無‘區室化’現象。（3）La3+和EGTA處理，在25 min内熒光完全猝滅；A23187和Ionomycin處理原生質體在10 min時熒光強度達到峰值。此外，當La3+降低原生質體的熒光後，A23187可以恢複Ca2+熒光值。總之，Fluo-8/AM等小分子熒光探針可以染色蘋果果肉胞質中的Ca2+，可用于檢測細胞質中Ca2+的時空變化。該方法可促進果實硬度形成機理的解析，有利于研發新技術提高蘋果果實的質地，提高果品品質。

　　Fig. 2 Loading of three kinds of Ca2+ fluorescent dyes into the protoplasts from flesh cells

　　Fig. 3 Fluorescence changes in Ca2+ in the same protoplast within 25 min. Pictures were taken every 5 min.

原文鍊接：https://doi.org/10.1038/s41438-020-0315-3